阿爾泰金銀花（Trolliusaltaicus），為毛茛科金銀花屬多年生長 木本植物，關鍵發(fā)育于在我國新疆阿勒泰、塔城地區(qū)，性微寒，具備清熱去火、消腫除菌、止血方法止咳化痰等作用，其干躁花骨朵臨床醫(yī)學上多用以上呼吸道感染、急慢性咽炎和扁桃體發(fā)炎等癥狀的醫(yī)治，本地民俗也將其泡茶食用以預防流感等病癥。殊不知，做為產品金銀花的來源于中藥材之一，該中藥材的分析報導較少。葒草素半乳糖苷等黃酮類碳苷類物質是該中藥材充分發(fā)揮藥力的關鍵活力成份，并進一步討論了其黃酮類物質的流回獲取加工工藝。超聲波輔助獲取是使用超聲的劇烈的震動、空蝕、拌和等效用毀壞植物細胞壁，推動相關成分溶解獲取有機溶劑中。酶輔助超聲波獲取法融合了酶法和超聲波獲取法的優(yōu)勢，不但獲取時間較短、獲取高效率，且能比較好地維持提取液的特點和質量，已經被普遍使用于中草藥材活力化學成分的獲取當中。文中擬深入探討酶制劑的類型、酶加上量、pH、料液比、獲取時間、獲取溫度及其獲取輸出功率對其所含黃酮類獲取率的危害，進一步融合Box-Behnken實驗方案設計和響應面分析，提升阿爾泰金銀花黃酮類物質的最好酶輔助超聲波獲取加工工藝，為阿爾泰金銀花以及黃酮類物質的深度開發(fā)給予參照數據信息。

一、原材料與方式

1、原材料與實驗試劑

阿爾泰金銀花中藥材于2016年8月收集于新疆阿勒泰地區(qū)，經新疆省藥物研究所何江副研究員評定為阿爾泰金銀花T.altaicus的干躁花骨朵，中藥材破碎，過40目篩。葒草素2-O-β-L-半乳糖苷標準品（OGA，上海源葉生物技術有限責任公司，質量濃度98.0%，P31O7F23952）；纖維素酶:（4×10⁵U/g）、半纖維素酶（1×10⁵U/g）果膠酶（3×10⁵U/g）和中性蛋白酶（5×10⁵U/g）各自購自上海市如吉生物技術發(fā)展有限責任公司；別的實驗試劑均為國內分析純。

2、儀器設備與機器設備

AS系列產品超聲波清洗機：天津市歐特賽恩斯儀器設備有限責任公司；DZKW-S-4電加熱恒溫水浴鍋：北京永光輝醫(yī)療設備有限責任公司；AL204型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器設備有限責任公司，751型紫外線由此可見光度計：上海市菁華高新科技儀器設備有限責任公司。

3、實驗方法

（1）標準品溶液的配制及標曲制作

高精密稱量干躁至恒重的OGA標準品5.0mg于25mL容量瓶中，用70%酒精融解、稀釋液至標尺，混勻、靜放，得0.20mg/mL的0GA標準品水溶液，儲存預留。各自高精密汲取標準品水溶液0mL、l.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL各自放置25mL容量瓶中，各放水至8.0mL，加5%亞硝酸鈉水溶液1.0mL，攪拌，置放6min后，加10%硝酸鋁水溶液1.0mL，攪拌置放6min后；加上4%氫氧化鈉溶液標準溶液10.0mL，放水至標尺，混勻置放15min，以相對應實驗試劑為空缺，在500nm處測量OD值（A），以A為縱軸，濃度值（C）為橫軸制作標曲，得線性回歸方程Y=0.523X-0.0109，R₂=0.9994，在0.008mg/mL～0.056mg/mL范疇內有優(yōu)良的線性相關關聯。

（2）試品水溶液制取以及黃酮類物質測量

稱量一定量阿爾泰金銀花，再各自向在其中加上不一樣容積不一樣含量的酒精，添加酶，在一定溫度下各自超聲波解決一定時間，制取供試試品水溶液。高精密稱量干躁至恒重的OGA標準品5.0mg于25mL容量瓶中，用70%酒精融解、稀釋液至標尺，混勻、靜放，得0.20mg/mL的0GA標準品水溶液，儲存預留。各自高精密汲取標準品水溶液0mL、l.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL各自放置25mL容量瓶中，各放水至8.0mL，加5%亞硝酸鈉水溶液1.0mL，攪拌，置放6min后，加10%硝酸鋁水溶液1.0mL，攪拌置放6min后；加上4%氫氧化鈉溶液標準溶液10.0mL，放水至標尺，混勻置放15min，以相對應實驗試劑為空缺，在500nm處測量OD值（A），以A為縱軸，濃度值（C）為橫軸制作標曲，得線性回歸方程Y=0.523X-0.0109，R₂=0.9994，在0.008mg/mL～0.056mg/mL范疇內有優(yōu)良的線性相關關聯。并測算獲取率。阿爾泰金銀花黃酮類物質獲取率Y（%）=（C×V/M）x100%，式中：C為萃取液中黃酮類濃度值（mg/mL），V為萃取液容積（mL），M為中藥材品質（mg）。

（3）酶制劑的挑選

稱量1.0g阿爾泰金銀花若干份，各自向當中添加占中藥材品質1.0%的纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、中性蛋白酶，將一份沒加一切酶制劑的試品作對照實驗。每一份試品各自加50倍量50%酒精，添加硫酸緩沖溶液，調pH各自設置3、4、5、6，將以上每組試品于40℃，超聲波輸出功率90W下超聲波獲取30min酶解后，每組試品經滅酶（開水浴5min），過慮獲得上清液。各自從每組中加入適量萃取液，測算金銀花黃酮類物質獲取率。

（4）單要素實驗

稱量中藥材1.0g，各自對超聲波酶輔助獲取加工工藝中的影響因素（酶加上量、料液比、獲取溫度、獲取時間、超聲波輸出功率）開展調查。酶加上量:0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%；料液比：1:10、1:20、1:30、1:40、1:50；乙醇濃度：30%、40%、50%、60%、70%；獲取溫度：35℃、40℃、45℃、50℃、55℃；獲取時間：10min、20min、30min、40min、50min；超聲波輸出功率：90W、132W、174W、216W、258W、300W。

（5）響應面試驗設計

依據Box-Behnken核心組合原理，在單要素實驗效果的根基上，挑選酶加上量、乙醇濃度、獲取時間和獲取溫度四個要素為變量，每一變量的實驗各自以-1、0、1編號，以黃酮類物質獲取率（%）為響應值，開展四要素三水準試驗，運用Design-Expert8.05手機軟件對實驗多元化回歸分析和二項式線性擬合，并對線性擬合方程式開展方差分析。要素水準設計方案見表1。

二、結果與剖析

1、酶制劑的挑選

不一樣酶制劑在不一樣pH標準下，所得的黃酮類物質獲取率都不同樣。伴隨著pH的提升，在各種各樣酶制劑功效下，阿爾泰金銀花黃酮類物質獲取率均出現先提高后下降的發(fā)展趨勢。從圖1能夠看得出，化學纖維酶在pH相當于4時功效最好是，其獲取率能夠做到17.09%，超過中性蛋白酶、半纖維素酶、果膠酶、無酶的作用下的獲取率。源液的pH為6.5，因而從獲取率考慮到，更改水溶液的pH為4，且挑選纖維素酶開展下一步實驗。