1.2.5 纖維素酶魅力的測(cè)量

分離出來菌種注射至LB液體培養(yǎng)基中，37℃塑造24h，連續(xù)傳代至第三代時(shí)獲得發(fā)酵物，離心式取上清液，即是菌種的粗酶液。CMC（羧甲基甲基纖維素）測(cè)定方法菌種生產(chǎn)纖維素酶的魅力。纖維素酶魅力界定為1mL酶液在50℃標(biāo)準(zhǔn)下1min水解反應(yīng)羧甲基甲基纖維素造成1μg葡萄糖水即是一個(gè)酶魅力企業(yè)（U/mL）。
 

在其中：m：從標(biāo)曲線性回歸方程測(cè)算得的葡萄糖水mg數(shù)；n：酶液稀釋倍數(shù)；0.5：測(cè)量時(shí)汲取稀釋液酶液mL數(shù)；30：表明反應(yīng)速度分鐘數(shù)。

2 結(jié)果與探討

2.1 纖維素酶活力菌種的挑選

從9個(gè)試品中國共產(chǎn)黨分離出來出21株菌，所有 為革蘭氏陽性病菌，經(jīng)CMC-Na固體培養(yǎng)基塑造，剛果紅染色液上色挑選，在其中有5株病菌可在CMC-Na固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生全透明圈菌體，結(jié)果如圖所示1所顯示。W1和W2菌種，來自納豆激酶試品W，R菌種來自納豆激酶試品R，F(xiàn)3菌種來自水豆豉試品F，F(xiàn)S來自水豆豉試品FS。在其中，以F3菌種水解反應(yīng)CMC-Na的能力最強(qiáng)，即纖維素酶活力最大，F(xiàn)S菌種的活力最少。因而，選擇來自發(fā)醇水豆豉的F3菌種做進(jìn)一步科學(xué)研究。

2.2 菌種的評(píng)定

2.2.1 組織學(xué)特點(diǎn)

F3菌種于LB固體培養(yǎng)基中37℃塑造24h，菌體及革蘭氏染色觀查結(jié)果如圖2所顯示。F3菌種可在LB固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生奶白色、不全透明、邊沿不規(guī)律的環(huán)形菌體，表層光潔，突起，材質(zhì)粘稠金屬拉絲。菌細(xì)胞為革蘭氏染色呈陽性，呈短桿狀，兩邊鈍圓，單獨(dú)排序，可產(chǎn)生顯著的芽胞。

2.2.2 16SrDNA基因序列剖析

F3菌種的16SrDNA遺傳基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到編碼序列長短為1437bp，根據(jù)BLAST剖析，發(fā)覺菌種F3與枯草芽孢菌屬開放閱讀框最大，接著將其與枯草芽孢菌屬內(nèi)方式菌種的16SrDNA基因序列開展多序列比對(duì)剖析，與此同時(shí)并以同為的Escherichiacoli方式菌種為外標(biāo)，并運(yùn)用NeighborJoining法搭建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖所示3所顯示。

由16SrDNA遺傳基因序列比對(duì)剖析得知，F(xiàn)3菌種與Bacillusamyloliquefacienssubsp.amyloliquefaciens、Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum2個(gè)方式菌種的親緣關(guān)系近期，但2個(gè)方式菌種的16SrDNA基因序列經(jīng)兩端對(duì)齊核對(duì)剖析發(fā)覺二者開放閱讀框超過99.5%，故沒法判斷F3菌種實(shí)際種的所屬。針對(duì)親緣關(guān)系較近的種間評(píng)定僅根據(jù)16SrDNA基因序列剖析是沒法達(dá)到的，需在其根本上憑借別的特殊看門基因序列搭建系統(tǒng)發(fā)育樹開展協(xié)同剖析，如gyrA、gyrB、recA、pheS、rpoA等。

2.2.3 gyrB基因序列剖析

為了更好地進(jìn)一步評(píng)定F3菌種，對(duì)其gyrB遺傳基因開展了PCR擴(kuò)增及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到 了gyrB遺傳基因的一部分編碼序列，長短為1115bp。將該菌種的gyrB基因序列同已經(jīng)知道枯草芽孢菌屬內(nèi)不一樣方式菌種的gyrB基因序列開展對(duì)比剖析，一樣并以同為的Escherichiacoli方式菌種為外標(biāo)，制作根據(jù)gyrB遺傳基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所顯示。

解木薯淀粉枯草芽孢菌綠色植物亞種與解木薯淀粉枯草芽孢菌解木薯淀粉亞種的gyrB基因序列開放閱讀框僅約為96%，而根據(jù)gyrB序列比對(duì)剖析發(fā)覺F3菌種與解木薯淀粉枯草芽孢菌綠色植物亞種親緣關(guān)系更近。因而，根據(jù)16SrDNA和gyrB遺傳基因序列比對(duì)剖析，可將F3菌種評(píng)定為解木薯淀粉枯草芽孢菌綠色植物亞種。