近年來，含砷灌溉水的使用導(dǎo)致砷污染農(nóng)田大面出現(xiàn)，農(nóng)田中的砷進一步通過食物鏈傳遞對人體健康造成危害。砷的生物毒性不僅取決于生物體中砷的含量，而且與砷的形態(tài)密切相關(guān)，砷可分為無機砷、有機砷和單質(zhì)砷，其中單質(zhì)砷溶解度較低，不易被人體吸收，而無機砷的毒性大于有機砷。在土壤與水環(huán)境中，可溶性砷形態(tài)主要為砷酸鹽As（Ⅴ）和亞砷酸鹽As（Ⅲ），在有氧條件下，As（Ⅴ）占主導(dǎo)地位，因此本研究選取砷酸鹽作為主要研究對象。生菜具有重要的食用價值和藥用價值，現(xiàn)已成為設(shè)施農(nóng)業(yè)和植物工廠的主要種植對象之一。本研究選取生菜作為研究對象，采用可以排除復(fù)雜土壤環(huán)境影響的水培方式，從砷酸鹽的生菜積累以及對其安全品質(zhì)影響方面開展研究。

腐植酸（Humicacid，HA）是一種天然存在的高絡(luò)合和聚合有機物，其豐富的含氧官能團（例如羧酸、酚羥基和醌官能團可以絡(luò)合許多金屬。
采用的腐植酸中的黃腐酸（富里酸）含量≥90%，其分子結(jié)構(gòu)中存在含氧活性基團，如羧基和酚羥基，同時還含有雜氮環(huán)，所以有離子交換性和與金屬離子形成螯合物的能力，另外含有的醌基和半醌基具有一定的氧化還原能力。黃腐酸能使作物根系發(fā)達，次生根數(shù)量增多，提高作物吸水力，并能降低葉面蒸騰作用，提高葉綠素含量，促進光合作用。此外，腐植酸還可以提高植物肥力，改善植物生長。因此，本研究進一步選取腐植酸對砷的植物毒性進行調(diào)節(jié)，旨在從生菜中砷的安全限量的角度，探究蔬菜中砷的累積規(guī)律以及砷和腐植酸對蔬菜的毒性調(diào)節(jié)作用，為蔬菜質(zhì)量安全及品質(zhì)改善提供數(shù)據(jù)，對修訂相關(guān)標準以及蔬菜的安全生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

一、材料與方法

1、生菜的培養(yǎng)及染毒

本研究選取玻璃生菜（Lettuce（IcebergL）作為研究對象，采用蛭石將生菜種子培育至四葉一心后，移入水培盆中，每個水培盆種植生菜12株。各水培盆中均裝有5L的Hoagland營養(yǎng)液，成分組成見表1。用NaOH調(diào)節(jié)pH為6.0，并及時補充蒸餾水至5L水位線，定期用充氧泵進行曝氣處理，定期測定培養(yǎng)液中砷含量的變化。

為考察不同砷酸鹽As（Ⅴ）初始添加濃度對生菜生長的影響，分別設(shè)置0.5、1、5、10、30mg·L-1的砷酸鹽濃度（分別表示為V-0.5、V-1、V-5、V-10、V-30，V代表五價砷，由于V-30處理組在生菜生長至第10d全部死亡，因此不再作分析），同時設(shè)置空白對照組（CK），以及不添加植物空白對照組（NP）。

為研究腐植酸對生菜砷脅迫的影響，選取V-10處理組，分別添加1、5、10mg·L^-1的腐植酸（分別表示為V10HA1、V10HA5、V10HA10，HA代表腐植酸），同時設(shè)置腐植酸的空白添加實驗，在不添加砷的營養(yǎng)液中分別添加腐植酸5、10mg·L-1（1分別表示為CKHA5、CKHA10）。其中腐植酸分子式為C9H9NO6，CAS：1415-93-6，黃腐酸（富里酸）含量≥90%。為考察不同生長期生菜生長表現(xiàn)，分別在生菜生長早期（生長至第10d，Day10）、中期（生長至第20d，快速生長期，Day20）、收獲期（生長至第30d，生長趨于穩(wěn)定，Day30）時，隨機選取生菜樣品3株，采用便攜式葉綠素儀（SPAD-502，MinoltaCamera，Osaka，Japan）對應(yīng)測定葉片的SPAD（Soilandplantanalyzerdevelotrnent）值，每個處理組測定30次取平均值。采集生菜樣品，分別進行植物鮮質(zhì)量、株高、根長的測定。

2、pH、砷總量及砷形態(tài)的測定方法染毒前，統(tǒng)一調(diào)節(jié)各實驗組中培養(yǎng)液pH為6.0。

在生菜3個對應(yīng)生長期，進行pH測定，并進一步采集10mL培養(yǎng)液，進行適當(dāng)稀釋后，測定培養(yǎng)液中的砷總量及形態(tài)。

在生菜不同生長期，從每個處理組中隨機采集生菜樣品3株，使用陶瓷剪刀將其剪碎并混勻。同時各植株分別稱取根、莖、葉樣品2g，每個樣品制備兩份，其中一份用于生菜中砷形態(tài)的測定，將樣品研磨后加入10mL提取劑（磷酸緩沖鹽：2mmol·L^-1磷酸氫二銨和0.2mmol·L^-1EDTA），250r·min^-1振蕩20min，8000r·min^-1離心5min，上清液經(jīng)0.45μm水系濾膜過濾后，上機測定。另外一份置于消解管中，加入10mL濃硝酸過夜，置于電熱消解儀上進行消解，升溫至120℃加熱0.5h，后升溫至150℃繼續(xù)加熱3h，再調(diào)至170℃趕酸至0.5mL，待消煮管內(nèi)液體冷卻后定容至10mL，上機測定。

溶液及生菜中砷形態(tài)的測定采用HPLC-ICP-MS（HPLC：Agilent1100；ICP-MS：AgilentTechnologies7700Series），流動相為20mmol·L^-1檸檬酸+5mmol·L^-1己烷磺酸鈉，采用NaOH調(diào)節(jié)pH為4.3，進樣量為20μL，流速為1mL·min^-1，測定過程中，通過添加質(zhì)控、監(jiān)控點以及復(fù)測方式進行質(zhì)量控制。

3、生菜品質(zhì)指標測定方法

為研究不同處理組在生菜快速生長期營養(yǎng)品質(zhì)變化，采用維生素C、可溶性糖、硝酸鹽、總酚測定試劑盒進行生菜品質(zhì)指標的測定，試劑盒均由南京建成生物有限公司提供。氨基酸的測定采用SykamS433D型氨基酸自動分析儀進行，氨基酸的提取采用王麗的方法。

4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

除另有說明外，每個實驗設(shè)置3個平行。采用SPSS22.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，通過T檢驗，當(dāng)P＜0.05時，認為具有顯著差異。同時采用SIMCA14.1軟件對氨基酸差異分布進行PLS-DA分析。

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