目的：為豬場實驗室提供科學的非洲豬瘟病毒核酸診斷試劑盒選擇方案。方法：選擇4種非洲豬瘟核酸檢測試劑盒，通過對比梯度稀釋后標準物質的線性擴增、對低含量時（20copies/μL）的敏感性、對以純水為樣本時假陽性檢出率。結果：線性擴增試驗中，A試劑盒對20copies/μL濃度的標準品檢測率為100%(3/3)，其他試劑盒對該濃度下的標準品，均未達到100%；低含量敏感性試驗中，A試劑盒陽性檢出率為91.67%(44/48)，其他廠家試劑盒的檢出率分別為85.42%(41/48)、79.17%(38/48)、58.33%(28/48)；假陽性試驗中，A和B未出現(xiàn)陽性反應，而C、D試劑盒分別出現(xiàn)2、1個非特異性反應。結論：經(jīng)過性能比較，A試劑盒更符合豬場實驗室對于高敏感性和低假陽性的要求。

非洲豬瘟病毒（AfricanSwinefevervirus，ASFV）是一類古老的病毒，早在1921年在非洲肯尼亞首次發(fā)現(xiàn)，至今有約100年的歷史。非洲豬瘟（Africanswinefever，ASF）即是由非洲豬瘟病毒引起的家豬、野豬的一種急性、熱性、高度接觸性動物傳染病，所有品種和年齡的豬均可感染，發(fā)病率和死亡率高，可達100%。世界動物衛(wèi)生組織將其列為法定報告動物疫病，中國也將其列為一類動物疫病。ASF最早于1921年在非洲肯尼亞被發(fā)現(xiàn)，1957年傳入歐洲，1971年傳入加勒比海地區(qū)和南美洲，2007年傳入高加索地區(qū)，現(xiàn)仍在非洲、南撒丁島和高加索地區(qū)流行，給世界各國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。2018年8月3日，中國確診首例非洲豬瘟疫情，之后不斷蔓延，2020年4月19日，海南報道非洲豬瘟疫情后，我國內地31個省份，已全部發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟疫情。

目前尚無有效的疫苗對非洲豬瘟進行防控，各地養(yǎng)殖場需依賴生物安全措施，并組建快速診斷實驗室，使用高精準的檢測方法，對進出入豬場物質進行監(jiān)測。該研究旨在通過比對不同廠家的非洲豬瘟核酸診斷試劑盒的主要性能，為豬場實驗室提供科學的試劑盒選擇方案，幫助豬場合理選擇試劑盒，構筑穩(wěn)固的生物安全檢測防線，阻擊非洲豬瘟的入侵。

1材料與方法

1.1試劑盒與標準物質

4種商品化的非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測試劑盒，A廠家試劑盒（非預混型）批次342020005，B廠家試劑盒（非預混型）批次202006，C廠家試劑盒（預混型）批次20191118，D廠家試劑盒（預混型）批次20200301;B646L基因標準品GBW(E)091034（批號：2020001）購自中國牧工商集團有限公司。

1.2試驗儀器

實時熒光定量PCR儀SLAN-48P購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1線性擴增試驗

將B646L基因標準品稀釋至1000copies/μL、100copies/μL、20copies/μL、4copies/μL、0.8copies/μL，共5個稀釋度，使用4種試劑盒，按照其說明書配置PCR體系，進行熒光PCR檢測，每個稀釋度重復3次，同時設置陰陽性對照。分析各試劑盒對不同梯度核酸檢測Ct值，比較不同試劑盒對各稀釋度的檢出率和變異系數(shù)。

1.3.2敏感性試驗

將B646L基因標準品稀釋至20copies/μL，使用4種試劑盒對稀釋后的標準品進行熒光PCR擴增，每種試劑盒重復檢測48個孔，統(tǒng)計該拷貝數(shù)下不同試劑盒的檢出率。

1.3.3假陽性檢測試驗

使用純化水做無模板陰性對照，每種試劑盒配置46個陰性反應，設置陰陽性對照。統(tǒng)計不同試劑盒出現(xiàn)假陽性的次數(shù)，假陽性概率最低者為佳。

2結果與分析

2.1線性擴增結果

使用4種試劑盒對稀釋后的標準品進行檢測時，4種試劑盒在1000copies/μL、100copies/μL兩種拷貝數(shù)的檢出率均為100%，在拷貝數(shù)稀釋至20copies/μL時出現(xiàn)檢出率的差異：A試劑盒的檢出率為100%(3/3)，B試劑：檢出率為33.33%(1/3)，C試劑盒的檢出率為33.33%(1/3)，D試劑盒的檢出率為66.67%(2/3）。A試劑盒在20copies/μL的檢出率高于其他試劑盒，具體結果見表1與表2。

2.2敏感性試驗結果

使用4種試劑盒對稀釋至20copies/μL的標準品進行檢測，結果顯示A試劑盒的檢出率最高為91.67%(44/48)，B試劑盒的檢出率次之為85.42%(41/48)，C試劑盒的檢出率為79.17%(38/48)，D試劑盒的檢出率為58.33%(28/48），具體結果見圖1與表3。

2.3假陽性檢測試驗結果

使用純水做無模板陰性，每種試劑盒配置46個陰性反應，設置陰陽性對照，統(tǒng)計不同試劑盒出現(xiàn)假陽性（有Ct值且曲線不典型）的次數(shù)，A試劑盒未檢到陽性，B試劑盒未檢測到陽性，C試劑盒檢測2個非特異性陽性反應，D試劑盒檢測到1個非特異性陽性反應，具體結果見圖2與表4。

3討論

該研究比較了4個廠家生產(chǎn)的非洲豬瘟核酸診斷試劑盒對B646L基因標準品的檢測結果，結果顯示：線性擴增試驗中，A試劑盒對20copies/μL濃度的標準品檢出率為100%(3/3），其他試劑盒對該濃度下的標準品的檢出率均未達到100%；敏感性試驗中，A試劑盒對稀釋至20copies/μL的48個重復，檢出率為91.67%(44/48），其他試劑盒的檢出率分別為85.42%(41/48）、79.17%(38/48）、58.33%(28/48）；假陽性試驗中，A試劑盒和B試劑盒，未出現(xiàn)陽性反應，C、D試劑盒分別出現(xiàn)2、1個非特異陽性反應。綜合3個試驗的結果，A試劑盒在不同稀釋濃度下的檢出率、低濃度（20copies/μL）的檢出率、假陽性出現(xiàn)頻次上領先其他試劑盒，更符合豬場實驗室對于高敏感性和低假陽性的需求，可以應用于豬場實驗室非洲豬瘟病毒的核酸診斷。

非洲豬瘟病毒對腐敗、溫度、干燥及消毒劑都具有較強的抵抗力。在適宜的蛋白質環(huán)境下，非洲豬瘟病毒可在較大的溫度范圍和pH范圍內存活，在血液、尿、糞中非常穩(wěn)定，能長時間存活于經(jīng)加工過的豬肉制品中。由于ASFV在環(huán)境中穩(wěn)定、存活時間長，生物安全是防控該病毒的唯一方案，進入豬場的物質和人員必須進行執(zhí)行嚴格的生物安全洗消，并進行核酸檢測。選擇一款敏感性高、假陽性少的試劑盒，能大大提升豬場生物安全牢固程度。

試劑盒的敏感性較低，可能與引物和探針序列、試劑盒生產(chǎn)工藝相關。在臨床檢測過程中，檢出率偏低除與試劑盒敏感性有關外，還可能與樣本復雜程度、樣本采集運輸、樣本核酸提取等各種因素相關；實驗室出現(xiàn)假陽性，可能與試劑盒不穩(wěn)定、實驗室污染、設備的閾值線設定等方面相關，豬場實驗室需要綜合各方面的因素進行判斷，該研究中C、D試劑盒為預混裝，產(chǎn)生的假陽性可能與試劑預混后，發(fā)生非特異性反應有關。

該研究僅對4個廠家試劑某一批號的檢測能力做了簡要比較分析，樣本量有限，并不能代表各試劑的整體檢測性能，僅作為一種試劑盒比對方案，供豬場實驗室參考，實驗室檢測能力除與試劑盒相關性能相關外，還需要實驗室的操作人員嚴格遵循標準操作流程，執(zhí)行嚴格的質量控制，避免因操作原因引起的假陰性和假陽性結果。